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產(chǎn)品中心技術(shù)服務(wù)病理形態(tài)學(xué)檢測原位雜交檢測
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更新時(shí)間：2025-03-06
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FISH實(shí)驗(yàn)方法及步驟
一.探針變性
將探針在75oC恒溫水浴中溫育5min，立即置0oC，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。
二.標(biāo)本變性
①將制備好的5-8um的玻片標(biāo)本于50oC培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。
②取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75oC的體積分?jǐn)?shù)70％甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。
③立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70％、體積分?jǐn)?shù)90％和體積分?jǐn)?shù)100％冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。
三.雜交
將已變性或預(yù)退火的DNA探針10μL 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37oC雜交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。
四.洗脫
此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。
（1） 雜交次日，將標(biāo)本從37oC溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。
（2） 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50oC的體積分?jǐn)?shù)50％甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。
（3） 在已預(yù)熱42～50oC的1×SSC中洗滌3次，每次5min。
（4） 在室溫下，將玻片標(biāo)本于2×SSC中輕洗一下。
（5） 取出玻片，自然干燥。
（6） 取200μL復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。
五.熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果
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